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          多光子顯微鏡

          發表時間:2022-02-24  |  點擊率:182

          多光子顯微鏡

          在多光子顯微鏡(也稱為非線性或雙光子顯微鏡)中,以兩倍正常激發波長照射樣品。更長的波長是有利的,因為它們可以更深地穿透樣品進行 3D 成像,并且因為它們不會損壞樣品,從而延長樣品壽命。為了實現多光子激發,照明光束在空間上聚焦(使用光學器件),同時使用高能短脈沖激發光束以提高兩個(或更多)光子同時到達同一位置(即熒光團分子)的概率。

          多光子顯微技術的例子包括二次諧波產生 (SHG)、三次諧波產生 (THG)、相干反斯托克斯拉曼光譜 (CARS) 和受激發射耗盡 (STED) 顯微技術。由于這些技術中的每一種都使用脈沖激光器,因此選擇能夠最大限度地減少脈沖色散的光學組件很重要,并且激光反射二向色鏡應具有低 GDD 特性。

          如圖 2 所示,典型的系統由激發激光器、掃描和成像光學器件、靈敏檢測器(通常是光電倍增管)和用于將熒光與激光器分離并阻擋激光的濾光片(二向色分光鏡)組成從到達檢測器(發射濾光片)。

          多光子成像系統提供的優勢包括真正的三維成像、對活組織內部深處進行成像的能力以及消除平面外熒光。

          使用這種方法,可以對斯托克斯位移非常短和/或效率非常低的熒光染料進行成像,甚至可以對樣品或組織中固有的熒光分子進行成像。多光子成像的缺點包括需要高峰值功率脈沖激光器,例如鎖模鈦:藍寶石激光器,并且直到現在,缺乏在整個發射范圍內提供足夠吞吐量的高性能濾光片。整個激光調諧范圍內的興趣和足夠的阻擋(圖 3)。

          圖 1:來自暴露的小鼠皮層的雙色體內雙光子成像。NADH 熒光(紅色)和硫羅丹明標記的星形膠質細胞(綠色)使用 BrightLine FF01-680/SP 發射器和 FF665-Di01 二向色鏡拍攝。圖片由羅徹斯特大學醫學中心神經外科系 Karl A. Kasischke 和 Nikhil Mutyal 提供。

          圖 2:多光子熒光顯微鏡的典型配置。

          圖 3:多光子顯微鏡需要在非常寬的光譜范圍內控制光:從近紫外一直到近紅外。

          針對多光子顯微鏡優化的 Semrock 濾光片Semrock 通過引入具有超高透射率、非常陡峭的邊緣和精心優化的阻擋的濾光片,為多光子用戶帶來了增強的性能??紤]到激發激光器和多光子成像系統的其他復雜元件通常需要多少投資,這些新的光學濾光片代表了一種簡單且廉價的升級,可以顯著提高系統性能。

          BrightLine®
          發射濾光片提供從近紫外到近紅外的清晰透射(圖 4)。事實上,與傳統濾光片的褐色色調相比,發射濾光片看起來像窗戶玻璃一樣清晰,而且 LWP 二向色鏡具有如此寬的反射帶,它們看起來像高反射鏡(圖 5)。發射濾光片還在 
          Ti:Sapphire 激光調諧范圍內提供深度阻擋,這對于實現高信噪比和測量靈敏度至關重要。

          有時需要限制在任何給定時間檢測到的熒光發射光譜帶,特別是當使用多個熒光團標記樣品中的不同目標時。較窄的帶通濾光片非常適合此目的,Semrock 提供了多種此類帶通濾光片,可與多光子發射濾光片結合使用,幾乎不會丟失熒光信號。

          由于非線性光學效應強烈依賴于激光脈沖的峰值強度,因此當脈沖展寬(以及隨之而來的峰值強度降低)保持在最/低限度時,會產生最有效的成像。BrightLine FF670-SDi01 和 FF720-SDi01 短波通二向色分束鏡旨在將激發激光反射到樣品,同時提供返回的近紫外和可見熒光或 SHG 信號的出色傳輸。與從這些分束鏡反射的激光相關的群延遲色散 (GDD) 非常低。例如,對于 FF670-SDi01 濾光片,100 fs 變換限制高斯脈沖在整個激光波長范圍內的加寬小于 2%,而對于 FF720-SDi01 濾光片在整個激光波長范圍內的加寬遠小于 1%。

          圖 4:BrightLine 多光子濾光片提供近乎理想的性能,如“近紫外和可見光"發射濾光片 FF01-680/SP 和二向色鏡 FF665-Di01 的這些典型測量光譜所示。

          圖5:圖 5: BrightLine 多光子濾光片非常清晰!

          圖6:使用Semrock多光子濾光片研究表明熒光Ca 2+指示劑蛋白(FCIPs),用于在使用雙光子顯微鏡活細胞研究的Ca2 +動態的功率。表達熒光蛋白 CerTN-L15 的 2/3 層神經元的三維重建。

          中間:3 張選定的圖像(每張在左側和右側分別用數字標記的深度拍攝)。圖片由慕尼黑工業大學神經科學研究所的 Olga Garaschuk 教授教授提供。(修改自 Heim 等人,Nat. Methods,4(2):127-9,2007 年 2 月。)(Modified from Heim et al., Nat. Methods, 4(2): 127-9, Feb. 2007.)

          光密度OD

          光學密度(Optical Density或稱為 OD)是描述光通過高度阻擋的光學濾光片(當光的傳輸非常小時)的透過率的一種方便工 具。OD簡單地定義為對數(底為10)的負變量。變量在0和1之間變化(OD = – log10(T))。因此,透過率就簡單等于10的負OD值的 方 (T = 10– OD), 左圖顯示了OD的影響:6個數量級(1000000次)的透過率變化,非常簡單地用介于0到6的數字來表示;下面中間 的示例表和右下的“法則"列表提供了一些方便的技巧,可以在 OD 和透過率之間快速轉換。將變量 T 乘以2(或除以10)等于減 去0.3(或加上1),就轉換成了 OD 。

          光密度本底噪聲:

          通過精心優化我們的測量設備和方法,Semrock能夠提供一些優化的寬帶光密度(OD)。以下是此網站上顯示的大多數測量數據的典型OD噪聲本底限制。

          對于介于320和1120 nm之間的波長,接近或低于3e-7(光學密度6.5)的透射值受到測量噪聲的限制。

          對于波長<320 nm且在1120-1500 nm之間的波長,接近或低于3e-6(光學密度5.5)的透射值受到測量噪聲的限制。

          對于大于1500 nm的波長,接近或低于1e-5(光學密度5.0)的透射值受到測量噪聲的限制。

          同樣,對于某些濾光片和/或某些阻擋波長范圍,顯示的本底噪聲僅為OD 4。




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